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做標準曲線樣品檢測時有幾個問題需要注意

發表時間:2019-07-24 15:40

      目前國際上zui流行的免疫檢測擬合方式是“四參數邏輯擬合",用這種擬合方式往往能夠比較的反映濃度和吸光度的曲線關系,從而進一步比較正確的獲得樣品中待測物質的濃度值

   用于免疫檢測的所謂“標準曲線"其實稱為擬合曲線比較合適。免疫檢測時標準點(可以是倍比稀釋的,也可以不是)濃度如果和相應的吸光度(OD)值如果能 夠呈現直線關系當然是zui理想的了,這時可以通過EXELL等方便的獲得擬合曲線,進而推算出樣品的濃度值。但我們做免疫檢測很少有時候能夠有這么理想的情 況,標品濃度和相應OD值往往是"S"型的曲線關系,這時就不能用直線擬合的方式了,而對擬合方法進行選擇就是必要的了。

       關于標準曲線的擬合方式,直線、二次曲線、三次曲線、指數、對數等雖都可用于ELISA及其它生物學反應中的曲線擬合,但都只適用于曲線的一部分,有的 適用于前半段,有的適用于后半段,有的適用于中間一段,而Logistic曲線則對曲線的全部都有較好的適用性。當然,如果用于定量,還是在中間一段較 好。這些方法雖然沒有一種方法可以通用,但也都可以用。關鍵在于你的標準曲線做到了S形的哪一部分,你想檢測的樣品濃度在曲線的哪一部分。在S曲線的低濃 度部分可以用乘冪方程很好的擬合,中低濃度部分可以用直線方程,中間部分可用對數方程,而中后段可用四參數。

    其實,在一個長的區間內,Logistic應該都能擬合得較為理想。但并不是說它就是的。事實上不僅是ELISA,其它很多生物學反應都是S形曲 線,也都可以用Logistic曲線擬合。但建模型是一回事,而用它來定量是另一回事。如果用來定量,S形曲線的中間段(較陡處)是比較好的,而兩端的平 坦部分計算誤差會大,有時甚至會很大。


二、做標準曲線樣品檢測時有幾個問題需要注意


1、樣品的濃度等指標是根據標準曲線計算出來的,所以首先要把做標準曲線看作是比做正式實驗還要重要的一件事,否則后面的實驗結果無從談起。


2、設置標準曲線樣品的標準濃度范圍要有一個比較大的跨度,并且要能涵蓋你所要檢測實驗樣品的濃度,即樣品的濃度要在標準曲線濃度范圍之內,包括上限和下限。而對于呈S型的標準曲線,盡量要使實驗樣品的濃度在中間坡度zui陡段,即曲線幾乎成直線的范圍內。


3、zui好采用倍比稀釋法配制標準曲線中的標準樣品濃度,這樣就能夠保證標準樣品的濃度不會出現較大的偏離。


4、檢測標準樣品時,應按濃度遞增順序進行,以減少高濃度對低濃度的影響,提高準確性。


5、標準曲線的樣品數一般為7個點,但至少要保證有5個點。


6、做出的標準曲線相關系數因實驗要求不同而有所變動,但一般來說,相關系數R至少要大于0.98,對于有些實驗,至少要0.99甚至是0.999.


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